È nata in Texas, figlia di George William Perabo, un docente statunitense di origini portoghesi che insegnava letteratura presso l'Ocean County College, e di Mary Charlotte Ulland, una fisioterapista statunitense di origini norvegesi. Chiamata Piper in onore dell'attrice Piper Laurie, studia presso la Toms River High School North, e successivamente si laurea presso l'Ohio University. Dopo la laurea si trasferisce a New York, dove inizia a lavorare in teatro. Dopo alcuni film minori, ottiene il primo ingaggio di una certa importanza nella pellicola Le avventure di Rocky e Bullwinkle con Robert De Niro.

Nel 2000 interpreta il ruolo che l'ha resa più celebre, quello di Violet ne Le ragazze del Coyote Ugly, seguito dal film L'altra metà dell'amore, pellicola a tematica lesbica che affronterà nuovamente, ma stavolta con toni non più cupi e drammatici, anche in Imagine Me & You. Negli anni successivi prende parte a pellicole come Una scatenata dozzina e al sequel Il ritorno della scatenata dozzina, con Steve Martin, Edison City, The Prestige di Christopher Nolan e Perché te lo dice mamma, con Diane Keaton.

Nel 2009 è protagonista nella commedia teatrale di Neil LaBute Reasons To Be Pretty a Broadway. Dal 2010 al 2015 è invece protagonista delle serie televisiva Covert Affairs, nel ruolo dell'agente della CIA Annie Walker. Nel frattempo, nel 2012 ottiene una piccola parte nel film Looper, al fianco di Bruce Willis e Joseph Gordon-Levitt.

Nel 2016 è la protagonista principale, insieme a Daniel Sunjata, della serie televisiva Notorious, mandata in onda per la prima volta dall'ABC il 22 settembre. Nella serie la Perabo recita i panni di una giornalista furba e intraprendente che in collaborazione con il suo amico avvocato, piega le regole del gioco per arrivare prima di tutti gli altri sullo scoop più succulento.